Recenzia roka MDJ: „Hlboké genotypovanie“ – Čo nás môže naučiť sekvenovanie tretej generácie

Názov článku je Prieskum neurogeneratívnych ochorení pomocou technológií sekvenovania s dlhým čítaním a optického mapovania genómu. Gratulujeme vám obom k tejto dôležitej nominácii. Dr. Cogan, povedzte nám niečo o vašom vzdelaní a čo vás inšpirovalo k napísaniu tohto článku.

Dr. Guillaume Cogan: Ahoj. Ďakujeme za pozvanie. Som lekársky genetik a teraz [00:01:00] robím doktorát na Parížskom inštitúte mozgu. Mali sme spoločný projekt Parížskeho inštitútu mozgu s Národnými inštitútmi zdravia, s našimi kolegami, ktorí sú tiež spoluautormi článku, Kensuke Daida, Cornelis Blauwendraat a Kimberly Billingsley.

Takže v podstate sme mali kohortu nevyriešených prípadov Parkinsonovej choroby, u ktorých sme vykonali sekvenovanie krvného exómu. Mali sme familiárne prípady a tiež prípady s včasným nástupom a chceli sme sa pokúsiť identifikovať niečo ako mutáciu, ktorá spôsobuje ochorenie. Na to sme použili sekvenovanie dlhých čítaní. Podrobnosti o tom rozoberiem v budúcnosti. Mali sme zaujímavý prípad, o ktorom sme chceli informovať v súvislosti s poruchami pohybu, tak sme to aj urobili. Redaktor nás požiadal, aby sme urobili prehľad o sekvenovaní dlhých čítaní, ale aj o optickom mapovaní genómu, aby sme získali prehľad o nových technológiách, nových genetických technológiách, ktoré môžeme použiť pri neurodegeneratívnych poruchách.

Dr. Sarah Camargosová: Veľmi pekné. Myslím si, že genetika sa niekedy môže zdať ako náročná téma pre [00:02:00] neurológov. Takže urobme krok späť a začnime so základmi. Budeme hovoriť o typoch variantov, ktoré spôsobujú neurodegeneratívne ochorenia, jednonukleotidových variantoch, štrukturálnych variantoch a opakovaných expanziách.

Mohli by ste, prosím, vysvetliť techniky používané na štúdium týchto variantov?

Profesor Alexis Brice: Áno, môžem začať a Guillaume dokončí. Myslím si, že naozaj dôležité je, že sekvenovanie dlhých čítaní znamená, že môžete analyzovať dlhé fragmenty DNA, namiesto toho, aby ste museli čítať asi 150 až 300 párov báz pre každý fragment, máte k dispozícii desiatky kilobáz, a to veľa mení.

Pretože môžete zistiť veľa preskupení [00:03:00], ktoré sa bežnými technikami nedetegujú. A to znamená, že napríklad keď je v géne inverzia, môžete vidieť spojovacie body. Môžete ich sekvenovať. Ľahšie môžete zistiť duplikácie alebo delécie.

A to je téma aj pre mnohé neurodegeneratívne ochorenia. A tiež pre opakované expanzie. Malé varianty sa dajú zachytiť klasickými technikami, ale akonáhle prekročia veľkosť 300 bázových párov, už to nie je možné. Takže pri sekvenovaní dlhých čítaní sa opäť dajú zachytiť tieto typy variantov.

Takže to sú najdôležitejšie aspekty. Ale sú tu aj iné. Môžete napríklad rozlíšiť jednotlivcov, ktorí majú dva varianty v géne. Môžete povedať, či sú v cis alebo trans variante. A v prípade recesívneho ochorenia [00:04:00] musia byť v trans variante, ak sa chcete uistiť, že sú zodpovední za ochorenie.

Môžete mať aj aplikácie pre gény a pseudogény, keď sú vysoko homológne, sekvenovanie dlhých čítaní umožňuje opäť sekvenovať gén nezávisle. Takže to je naozaj základ a určite môžeme poskytnúť niekoľko príkladov, ak chcete.

Dr. Sarah Camargosová: Veľmi pekné. Obzvlášť keď som čítal váš článok, veľmi ma zaujalo, že používate tieto príklady na ukázanie výhod sekvenovania dlhých čítaní, ako napríklad spomínané pseudogény a fázovanie. Mohli by ste sa s nami podeliť o príbeh o súrodencoch a dvojičkách s variantmi PRKN? 

Dr. Guillaume Cogan: Áno. Takže náš kolega z NIH, Kensuke Daida, mal najprv týchto dvoch súrodencov s fenotypom, ktorý bol kompatibilný s Parkinsonovou chorobou. [00:05:00] Takže súrodenci mali skorý nástup, pomalú progresiu ochorenia a myslím, že išlo o sekvenovanie exómu. Takže sekvenovanie s krátkym čítaním.

Mali patogénny jednonukleotidový variant, ale iba jeden variant, takže to nestačí na vysvetlenie choroby. Potom použili sekvenovanie s dlhým čítaním a identifikovali inverziu v druhej alele, čo vysvetľuje chorobu. A táto inverzia bola veľmi veľká. Je to sedem megabáz.

Takže to vysvetľuje, prečo to nedostali ako prví. A potom z našej kohorty. Mali sme tiež dvoch súrodencov s autozomálne recesívnou formou ochorenia kompatibilnou s PRKN, opäť s týmto fenotypom. A najprv sme použili konvenčné sekvenčné metódy - amplifikáciu viacnásobnou ligáciou sond, cielené sekvenovanie s exómovým sekvenovaním.

A mali sme deléciu exómu štyri, ale opäť iba jednu mutáciu, takže to nestačilo na vysvetlenie ochorenia. Opäť sme použili sekvenovanie s dlhým čítaním a zistili sme, že je to veľmi zaujímavé. Takže v prvej štúdii sme [00:06:00] mali deléciu exómu tri a exómu štyri a v druhej pridanej mutácii sme mali duplikáciu exómu tri.

Takže celkovo máme dve kópie exómu tri, čo je normálne, však? Dúfam, že tu všetci máme dve kópie exómu tri.

Dúfam, a to je dôvod, prečo ostatné sekvenčné nástroje to nedokázali vidieť. A iba, povedzme, iba sekvenovanie dlhého čítania to dokázalo identifikovať.

A potom Kensuke a kolegovia rozšírili túto štúdiu na, myslím, 23 jedincov s jedným variantom PRKN a skorým nástupom Parkinsonovej choroby a dokázali vyriešiť štvrtinu prípadov pomocou sekvenovania s dlhým čítaním. Takže toto je niečo, čo má zmysel, myslím si. A neurológovia by o tom mohli premýšľať, keď majú pacienta s jednou mutáciou v PRKN a kompatibilným fenotypom.

Dr. Sarah Camargosová: A boli ste vedení iba pri fenotypizácii. To je veľmi zaujímavé. Takže ste trochu pátrali, aby ste zistili, či existuje štrukturálny variant, ktorý by mohol vysvetliť tú druhú trans [00:07:00] variáciu.

Je to správne? 

Dr. Guillaume Cogan: Jo.

Dr. Sarah Camargosová: Úžasné. Okrem objavenia nových génov je ďalším zaujímavým aspektom na preskúmanie charakterizácia opakovanej expanzie.

Aký je význam tejto charakterizácie pre pochopenie fenotypu alebo genetického poradenstva?

Profesor Alexis Brice: Myslím si, že existujú aspoň dva aspekty opakovanej expanzie. Po prvé, je to veľkosť a vhodná veľkosť je veľmi dôležitá, pretože zvyčajne existuje prahová hodnota, nad ktorou možno opakovanie považovať za patogénne. A tá sa veľmi líši v závislosti od poruchy. A pri niektorých z nich musím povedať, že prahová hodnota môže byť cenná, je stále sporná, ale aspoň nad určitou hodnotou si môžete byť istí, že je to patogénne.

Takže prvým je veľkosť, ktorá je pre diagnózu absolútne [00:08:00] kľúčová. A druhým aspektom je sekvencia opakovania. Pretože sa ukazuje, že v niektorých lokusoch nie je dôležitá len veľkosť, ale aj zloženie opakovania. A existujú alternatívne zloženia, z ktorých niektoré sú patogénne a iné sú dobre tolerované a nesúvisia s ochorením.

Pri sekvenovaní dlhých čítaní získate oboje z jedného kameňa. Máte k dispozícii veľkosť aj zloženie opakovania, a preto môžete povedať, či je opakovanie patogénne alebo nie. A to je veľmi dôležité pre mnohé nedávno identifikované opakovania, napríklad FGF 14 alebo RFC 1.

Dr. Guillaume Cogan: Áno, možno môžem uviesť príklady. FGF 14 je veľmi dobrý príklad. Je teda zodpovedný za [00:09:00] spinocerebelárnu ataxiu číslo 27 B, ktorá bola identifikovaná pomerne nedávno a vieme, že expanzie GAA, ktoré sú nižšie ako 200, nie sú patogénne. Keď je však opakovanie nad 300, vieme, že je patogénne a používame krátke sekvenovanie čítania, pretože veľkosť fragmentu čítania je približne 150.

Nemôžeme vedieť nič, čo je dlhšie. Môžeme len povedať, že existuje expanzia nad 150, ale nevieme povedať, či je nad 300 alebo nie. Takže nevieme povedať, či je to patogénne, a na to potrebujeme ďalšiu technológiu. Ale pomocou sekvenovania dlhých čítaní vieme presnejšie určiť veľkosť expanzie a vieme povedať, či je expanzia nad prahovou hodnotou alebo nie.

Ďalším príkladom dôležitosti motívu je gén zodpovedný za známy syndróm cerebelárnej ataxie, neuropatie, vestibulárnej areflexie, teda CANVAS. Vieme, že dlhé expanzie [00:10:00] AAAG, teda päť nukleotidov, nie sú patogénne. Expanzie motívu AAGGG sú však patogénne a pomocou sekvenovania dlhých čítaní máme motív, takže vieme, či je patogénny alebo nie.

A myslím si, že dôležitá je aj prítomnosť alebo neprítomnosť prerušení. A o tom v článku diskutujeme. Myslím si, že dobrým príkladom je spinocerebelárna ataxia číslo dva. Ide teda o rozšírenie CAG. A ak v tomto rozšírení CAG máme prerušenie alebo niekoľko prerušení CAA namiesto CAG, vieme, že to nie je zodpovedné za spinocerebelárnu ataxiu, ale za Parkinsonovu chorobu.

Motívom je prítomnosť alebo neprítomnosť integrácie, ktorá je dôležitá pre fenotyp, ale aj pre vek nástupu, penetranciu, dedičnosť ochorenia a závažnosť a typ fenotypu. 

Profesor Alexis Brice: Takže určite môžeme očakávať, že v budúcnosti identifikujeme viac takýchto opakovaní. A vieme, že pri neurologických poruchách sú obzvlášť časté.

Takže si myslím, že sekvenovaním oveľa väčšieho množstva prípadov určite v budúcnosti objavíme neznáme mutácie.

Dr. Sarah Camargosová: A tiež ste si mohli overiť metyláciu. Môžete sa dozvedieť o niečo viac o génovej expresii.

Dr. Guillaume Cogan: Rozhodne s použitím hlavných metód sekvenovania dlhých čítaní. Vieme identifikovať metyláciu, čo má samozrejme niekoľko dôsledkov pri ochoreniach, pretože zvyčajne to tak nie je. Ale hypermetylované prvky v DNA majú zvyčajne menšiu expresiu v porovnaní s hypometyláciou.

A v kontexte neurodegeneratívnych porúch. Myslím si, že je to zaujímavé. Napríklad, ak máme gén. Práve sme to študovali pre NOTCH2NLC, ktorý je zodpovedný za expanziu GGC v oblasti piatich premateriálov, keď [00:12:00] máte GGC. Je zodpovedný za ochorenie nazývané Neuronálna intranukleárna hyalínová inklúzna choroba a zistili, že je veľmi zaujímavé, že nepostihnutí rodičia detí postihnutých touto chorobou mali dlhšie expanzie v porovnaní s potomkami. Takže sa to neočakávalo, však? Ale pomocou sekvenovania dlhých čítaní zistili, že táto expanzia GGC u rodičov bola hypermetylovaná. Takže gén bol menej exprimovaný v porovnaní s nižšou expanziou. A táto expanzia je patogénna, pretože vedie k RNA 4C, čo vedie k sekvestrácii proteínov viažucich RNA.

Takže v podstate, ak máte nižšiu expresiu, máte menej RNA 4C a potom nemáte ochorenie. Je veľmi zaujímavé vidieť, že metylácia nám umožňuje pochopiť, prečo niektoré mutácie nie sú patogénne v porovnaní s inými.

Dr. Sarah Camargosová: Úžasné. Veľmi zaujímavé. [00:13:00] Poďme sa trochu porozprávať o cielenom sekvenovaní dlhých čítaní. V apríli 2024 sme urobili rozhovor s profesorom Houldenom a Dr. Zhongbom Chenom, ktorí použili cielené sekvenovanie dlhých čítaní na opis SCA4. Mohli by ste nám pripomenúť, ako táto metóda funguje a či existuje iná metodika na cielenie namiesto sekvenovania všetkého?

Dr. Guillaume Cogan: Áno. Je to dobrá otázka, pretože sekvenovanie dlhých čítaní sa dá použiť v niekoľkých aspektoch. Môžete teda sekvenovať celý genóm, ale môžete robiť aj cielené sekvenovanie. A povedal by som, že v článku hovoríme o troch metódach, ako to urobiť. Po prvé, môžete použiť metódu založenú na Cas9.

Takže pomocou CRISPR Cas9 zachytíte požadovanú oblasť a potom túto požadovanú oblasť sekvenujete. Toto je prvý príklad. Ďalší je tiež jednoduchý. Je to PCR s dlhým dosahom. Takže amplifikujete požadovanú oblasť pomocou PCR s dlhým dosahom [00:14:00] spolu. Ale samozrejme, ak použijete toto, môžete mať amplifikačné skreslenie, pretože používate polymerázovú reťazovú reakciu, však?

 Takže toto je druhý a ten posledný poskytuje iba spoločnosť Oxford Nanopore Technologies. Takže posledný je adaptívne vzorkovanie a je celkom zaujímavý.

Takže v podstate máte vlákno DNA, ktoré prechádza pórom. A pór analyzuje prvých 100 párov báz. Napríklad 400 párov báz a zistí, či sa tieto páry báz nachádzajú v oblasti záujmu, ktorú má sekvenátor sekvenovať. Ak teda zistí, že tento fragment nie je fragmentom záujmu, vyhodí ho.

Takže sekvenuje iba cez všetky pórové fragmenty, ktoré nás zaujímajú. Toto sú teda tri metódy: na báze Cas9, PCR s dlhým dosahom a adaptívny odber vzoriek ONT.

Dr. Sarah Camargosová: Veľmi pekné. Profesor Brice, mám pocit, že sekvenovanie dlhých čítaní je takmer ako genetická verzia [00:15:00] hlbokého fenotypovania, niečo ako hlboké genotypovanie. Súhlasíte?

Profesor Alexis Brice: Plne súhlasím, pri hlbokom fenotypovaní nájdete veci, ktoré ste nevideli, pretože ste ich poriadne nehľadali. A myslím si, že je pre neurológov naozaj dôležité, aby mohli vykonávať toto hlboké fenotypovanie, ktoré môže pomôcť pri diagnostike. A tu je to úplne to isté, pretože nástroje, ktoré sme používali až do sekvenovania s dlhým čítaním, neboli schopné niektoré z týchto variantov detekovať.

A teraz, keď máme tento nástroj, vieme tieto varianty zachytiť a zlepšiť diagnostiku. Takže je to naozaj veľmi podobné, až na to, že náklady na hlboké fenotypovanie by mohli byť v súčasnosti nižšie ako pri sekvenovaní s dlhým čítaním.

Dr. Sarah Camargosová: Áno. Keď už hovoríme o výzvach týkajúcich sa sekvenovania dlhých čítaní, aké sú pre nás [00:16:00] veľké výzvy? Okrem nákladov.

Dr. Guillaume Cogan: Okrem nákladov sú výzvou predovšetkým mokré laboratórium. Protokol mokrého laboratória teda ešte nie je štandardizovaný. Taktiež nie je štandardizovaný bioinformatický kanál na volanie rozptylu. A tiež potrebujete veľa úložných kapacít dát, pretože generuje stovky gigabáz.

Takže potrebujete dobrú úložnú kapacitu. Aj dobré GPU a CPU na vyhodnotenie rozptylu sú veľmi výpočtovo náročné a na konci reťazca, povedzme, interpretácia rozptylu je tiež ťažšia, pretože máme oveľa väčší rozptyl. Aspoň sme si istí naším rozptylom, pretože napríklad, ak robíte krátke sekvenovanie čítania, snažíte sa analyzovať štrukturálny rozptyl, viete, že mnohé z nich sú len falošne pozitívne. Ale pri použití dlhého sekvenovania čítania viete, že väčšina z nich sú skutočne pozitívne. Avšak keď analyzujeme rozptyl, ak chcete identifikovať príčinu ochorenia pacienta, chcete odstrániť rozptyl, ktorý má vysokú [00:17:00] frekvenciu, ktorá je bežná, priamo u každého z nás, len na výber variantov.

Problém je v tom, že pri dlhodobom sekvenovaní nemáme katalógy ako Genome 80 na sekvenovanie krátkych čítaní. Preto je ťažké filtrovať varianciu krátkych čítaní. Napriek tomu existujú niektoré kolaboratívne projekty, napríklad projekt 1000 Genome, ktorý sekvenuje stovky, ak nie tisíce zdravých kontrolných skupín, aby nám poskytol populačné databázy, čo nám umožňuje zobraziť varianciu podľa frekvencie.

A nakoniec, keďže s tým mám už nejaké skúsenosti, niekedy je to frustrujúce, pretože si hovoríte: „Sekvenujem všetky typy variácií, ktoré mám, ako SND štrukturálnej variácie, krátke čítacie opakovania, ale nenachádzam genetickú mutáciu.“ Viem však, že tu niekde je, ale môžem uviesť možno jeden príklad.

Napríklad máme intrónové štrukturálne varianty, ktoré môžu ovplyvniť zostrih génu, ale nemáme žiadny nástroj na predpovedanie, či to zostrih ovplyvňuje alebo nie. Dúfame teda, že v budúcnosti bioinformatici [00:18:00] vyvinú tieto nástroje, aby sme konečne mohli identifikovať príčinu ochorenia všetkých ľudí s genetickou poruchou, povedzme.

Dr. Sarah Camargosová: Alebo dokonca sekvenovali aj všetku RNA.

Dr. Brice alebo Cogan: Áno, toto je ďalšie. Pomocou dlhého sekvenovania. Áno, môžeme identifikovať nové izoformy, o ktorých hovoríme v článku.

Dr. Sarah Camargosová: A tiež vo svojom článku ste skúmali možnosti optického mapovania genómu. Vysvetlite nám, ako táto technika funguje a aké sú jej hlavné výhody.

Dr. Guillaume Cogan: Takže je to dosť odlišné od sekvenovania s dlhým čítaním, pretože to nie je sekvenovanie. V podstate si len označíte DNA v nejakej kanonickej sekvencii, krátkych sekvenciách, a potom máte mikroskop, ktorý sleduje vzdialenosť medzi označenými značkami DNA. Takže s tým môžete identifikovať štrukturálne varianty, ktoré majú viac ako 500 párov báz.

Takže pod tým nič nevidíte. To je jedna vec. Pomocou optického mapovania genómu [00:19:00] nevidíte ani SND, jednonukleotidové varianty. Je to však dosť zaujímavé, pretože hĺbka a pokrytie sú lepšie v porovnaní so sekvenovaním dlhých čítaní. Pomocou OGM môžete dosiahnuť hĺbku pokrytia 150x v porovnaní s bežnými 20 až 30x pri sekvenovaní dlhých čítaní.

A áno, to je podľa mňa hlavná vec pri OGM. Niektorí ľudia porovnávali OGM a sekvenovanie dlhých čítaní. A pri sekvenovaní dlhých čítaní je ťažké identifikovať varianty, štrukturálne varianty, ktoré sú nad 50 kb. OGM je však dobrý na identifikáciu takýchto mutácií. Takže by som povedal, že ak máte peniaze, môžete použiť oba a to by bolo najlepšie.

Ale na to potrebuješ peniaze 

Dr. Sarah Camargosová: Samozrejme.

Profesor Alexis Brice: Nie, myslím tým, že potrebujete aj DNA s vysokou molekulovou hmotnosťou a to je niekedy obmedzenie pre tieto techniky. A klasické biobanky niekedy používajú extrakčné techniky [00:20:00], ktoré takúto DNA neposkytujú. Takže je to niečo, čo musíte vziať do úvahy aspoň pre potenciálne kohorty alebo vzorky, ktoré získavate.

Dr. Guillaume Cogan: Áno. A ešte niečo k OGM. Myslím si, že obmedzením OGM, ktoré je dobré vedieť pre poslucháčov, je, že je veľmi ťažké získať presnú polohu bodov zlomu pomocou OGM. Bežne sa to nedá zistiť. Je to medzi 6 KB a 15 kb. Takže to môže byť dôležité v lekárskej genetike, pretože pomocou OGM môžete povedať, že štrukturálny variant zahŕňa exóm, zatiaľ čo to tak nie je, takže to nie je falošne pozitívny výsledok, ale nie je to také presné pre štrukturálnu variáciu ako sekvenovanie s dlhým čítaním.

Takže opäť, je dobré použiť oboje, ak chcete používať OGM, áno.

Dr. Sarah Camargosová: Takže predpokladáte, že tieto dve technológie by sa v budúcnosti stali prvým prístupom k diagnostike dedičných neurogeneratívnych porúch? 

Profesor Alexis Brice: Za predpokladu, že sú k dispozícii peniaze [00:21:00] na ich zaplatenie. Áno, myslím si, že jednoznačne umožňujú vyriešiť väčší podiel prípadov, a preto sú veľmi užitočné. Myslím si, že ak chceme mať prístup prvej a poslednej úrovne, kde jedna technológia dokáže poskytnúť výsledky.

Dr. Guillaume Cogan: Áno, povedal by som, že je pred nami ešte dlhá cesta, kým sa tieto technológie dostanú ako prví.

Dr. Sarah Camargosová: Áno. Veľmi pekné. Predtým, ako skončíme, je tu jedno kľúčové posolstvo, ktoré by ste chceli, aby si naši poslucháči odniesli z týchto novín?

Dr. Guillaume Cogan: Áno. Myslím si, že pred použitím týchto technológií musíte poznať svoj projekt a čo naozaj chcete vidieť. A myslím si, že v našom článku sme sa snažili čo najlepšie uviesť príklady, aby čitateľ pochopil, čo môže s týmito technológiami získať. A myslím si, že áno, čítanie tohto článku je spôsob, ako to lepšie pochopiť a použiť to vhodným spôsobom pre každý projekt. [00:22:00] Áno.

Dr. Sarah Camargosová: Áno. Takže lekári, veľmi pekne vám ďakujeme, že ste sa k nám pridali. A že ste sa s nami podelili o svoje postrehy. Ďakujeme všetkým našim poslucháčom, že sú s nami v podcaste MDS. Zostaňte naladení na ďalšiu epizódu a dovtedy sa majte dobre a dovidenia.

Dr. Guillaume Cogan: Ďakujeme, že nás máte.